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Qu'est-ce qu'un O.G.M.
Un OGM est un Organisme Génétiquement Modifié.
Ce terme désigne tout organisme vivant modifié par le biais du génétique : Levures, plantes, etc. des bactéries génétiquement modifiées sont utilisées depuis de nombreuses années pour la fabrication de fromages, d'enzymes et de médicaments. Une plante génétiquement modifiée est une plante dont le patrimoine génétique (ou génome) à été enrichi par un transfert d'un gène supplémentaire, appelé transgène, qui lui donne un avantage particulier, comme la résistance à des insectes nuisibles ou à des maladies, par exemple.
Comment fabrique-t-on un O.G.M. ?
Repérage d'un caractère intéressant :
Pour repérer des caractères intéressants sur un organisme, on effectue une étude des cartes génétiques. En effet, le génome de tout organisme est constitué par son ADN, qui représente le matériel génétique fournissant les instructions pour fabriquer les molécules qui constituent cet organisme. La génomique est l'étude du génome d'un organisme. Le but de ces approches vise à comprendre la fonction biologique correspondant à chaque gène, c'est à dire à repérer les séquences d'ADN qui codent pour telle ou telle protéine ; la protéine étant responsable d'un caractère précis.
Remarque : Les organismes n'ont pas tous le même nombre de gènes :
Bactéries :
Bacillus subtilis (~500 à 8000 gènes)
Levure : Saccharomyces cerevisiae (~6000 gènes)
Animaux : Souris et homme (~30000 gènes)
Plantes : riz, maïs,... (~25000 gènes)
Plus le
nombre de gènes est important, plus la probabilité est forte pour qu'il y
ait des mutations naturelles, permettant une plus grande chance de survie
dans certaines conditions.
De nombreux gènes sont dupliqués et 30 à 40% des gènes codent des protéines
de fonction totalement inconnue, c'est pour cela que la plupart des
recherches portent sur l'études des différents génomes.
Isolement d’ une séquence de gène:
Enzymes
de restriction et ADN ligase :
Les enzymes de restriction sont les agents les plus importants dans les
manipulations génétiques. Leur mode d'action consiste à couper l'ADN d'après
un mécanisme nommé restriction, (d'où leur nom !) Elles ont un rôle très
spécifique : elles effectuent des coupures à des points précis de séquences
d'ADN. Il existe plusieurs centaines d'enzymes de restriction et plus de 150
séquences de restrictions différentes. Le schéma ci dessous montre une
séquence contenant deux séquences de reconnaissance pour une enzyme donnée.
Les enzymes de restriction coupent les liaisons covalentes (phosphates) des
deux brins, souvent de façon décalée. Grâce aux liaisons hydrogènes, les
fragments d'ADN s'apparieront avec les segment complémentaires, portés par
une autre molécule découpée par la même enzyme. Ces liaisons peuvent être
rendues définitives si l'on utilise l'ADN ligase pour rattacher les brins.
On obtient ainsi une molécule d'ADN porteuse des nouvelles combinaisons de
gène.
Dans cet exemple, l'enzyme de restriction (appelée EcoRI) reconnait une sequence de six paires de bases et effectue une coupure dans l'axe désoxyribose-phosphate de cette séquence. Les extrémités complémentaires adhéreront l'une à l'autre par l'intermédiaire des liaisons hydrogène. Vient ensuite l'ADN ligase, qui forme des liaisons covalentes entre les extrémités.
Multiplication de la construction génétique : la PCR
La technique d'amplification génique in vitro connue sous le sigle P.C.R. (Polymerase
Chain Reaction) consiste en une multiplication exponentielle d'un fragment
d'acide nucléique dont la taille est généralement comprise entre 200 et 3
000 paires de bases.
Cette technique utilise une ADN polymérase particulière, dénommée Taq
polymérase, issue d'une bactérie (Thermophilus aquaticus) vivant dans des
sources d'eau chaude, près des fumeurs noirs. Cette enzyme est stable à
haute température et reste active pendant le déroulement de la P.C.R. Elle
s'effectue dans un appareil appelé thermocycleur, qui assure automatiquement
la variation de température rapide entre des plateaux programmés le nombre
de fois requis.
La technique P.C.R. est un enchaînement de cycles (généralement de 20 à 40) qui comprennent chacun les trois étapes suivantes :
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dénaturation thermique (2 min à 92°C) de l'ADN-cible de la construction génétique à analyser : les deux brins constitutifs de l'ADN sont séparés ; |
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hybridation : appariement de ces deux brins avec des oligonucléotides (appelés amorces) choisis pour encadrer le fragment que l'on souhaite amplifier; un oligonucléotide est complémentaire d'une séquence présente sur l'un des brins, le second est complémentaire d'une séquence présente sur l'autre brin ; |
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élongation de chaque amorce par la Taq Polymérase (thermostable) : Etant donné les conditions de chaleur extrême lors de la PCR, peu d'enzymes résistent, c'est pourquoi dans la PCR utilise la Taq Polymérase, thermostable : elle résiste à la chaleur, ce qui évite à chaque fois de réintroduire une nouvelle enzyme (ce qui se faisait jusqu'alors). Le chercheur ayant eut l'idée d'utiliser une enzyme thermostable a d'ailleurs reçu un prix Nobel. Cette enzyme ajoute des nucléotides aux extrémités 3 des amorces en respectant les règles d'appariement des bases azotées : l'Adénine (A) avec la Thymine (T) et la Cytosine (C) avec la Guanine (G). |
Et le cycle continue... Chaque cycle aboutit théoriquement au doublement de la quantité du fragment situé entre les deux amorces, de telle sorte que la technique P.C.R. permet en quelques heures une amplification spécifique de cent mille à plusieurs millions de copies.
Mode d'implantation de gènes sur un végétal :
Un vecteur biologique : des bactéries comme
agents de transgenèse :
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Le vecteur ADN
le plus perfectionné est un plasmide d'Agrobacterium tumefaciens, une
bactérie. Un plasmide est un petit ADN circulaire qui se multiplie de
manière autonome dans la bactérie. Il peut abriter un fragment d'ADN
étranger ; et permet ainsi d'isoler les gènes d'un être vivant. Dans la
nature, l'Agrobacterium tumefaciens infecte les végétaux et cause des
tumeurs (« galle du collet »). Le plasmide, nommé plasmide Ti (Tumor-Inducing)
provoque l'apparition de ces tumeurs. Il intègre un segment d'ADN (ADN-T
ou ADN Transformé), dans l'ADN chromosomique des cellules de l'hôte
végétal. |
1) On isole le plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens , et on insère un fragment d'ADN étranger par les techniques de recombinaison de l'ADN. Le plasmide recombiné contenant le gène recherché peut être au préalable multiplié par la technique de PCRb (in vitro).
2) Lorsque le plasmide recombiné s'introduit dans les cellules végétales en culture, l'ADN-T s'intègre à l'ADN de la cellule végétale.
3) Voir « Régénération du plan »
Des techniques de transfert direct :
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Les monocotylédones, qui comprennent des graminées très utilisées en agriculture comme le maïs, le blé, le riz, le coton, le soja, restent à l'abri de la contamination par le plasmide Ti. La biolistique consiste à introduire directement de l'ADN dans le noyau des cellules végétales par projection de microbilles métalliques porteuses de cet ADN (contenant le caractère recherché). La technique consiste à faire exploser des cartouches de plastique garnies de minuscules granules métalliques (or ou tungstène) recouverts d'ADN, à l'aide d'un canon à particules, appelé « gun ». Les granules traversent les parois cellulaire et atteignent le cytoplasme de la plantule (jeune plante germée). C'est lorsque les cellules réparent les perforations de la paroi que l'ADN s'intègre dans celui de la cellule végétale. |
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On a aussi mis au point une autre technique d'introduction directe de l'ADN dans des cellules eucaryotes (champignon, animaux, et notamment plante): l'électroporation. Ce procédé vise à appliquer une courte impulsion électrique dans une solution contenant des cellules, ce qui provoque l'apparition d'ouvertures dans la membrane plasmique par lesquelles l'ADN peut passer. |
Régénération de la plante transformée:
Lors des mitoses cellulaires, il se produit un copie de l'ADN-T. Si la plante se régénère en entier, elle portera les nouveaux gènes.
Pour mener à bien l'implantation d'un nouveau gène dans une plante, et ainsi créer une multiplication de cette dernière, l'être végétal nécessite d'être régénérée. Il est ainsi cultivé dans des boîtes dites de «Pétri» qui permettent la culture de celles-ci sur des milieux solides. C'est à ce stade que les plantes ne portant pas le gène d'intérêt sont détruites ; par la suite, il est vérifié l'expression du gène, ainsi que sa stabilité dans le temps.